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Meccanismi di regolazionepost-trascrizionale dell'espressione genica nelle demenze

La malattia di Alzheimer è caratterizzata dalla presenza di ammassi neurofibrillari formati dalla proteina Tau in uno stato di iperfosforilazione; tale fosforilazione anomala costituisce lo stadio più dannoso della degenerazione neurofibrillare. La chinasi CDK5 è coinvolta nell’insorgenza dell’Alzheimer poiché è responsabile della iperfosforilazione di Tau in diverse posizioni della proteina. L’attivazione di CDK5 richiede l’interazione con p35 e p39, o con i prodotti della loro digestione ad opera della calpaina, p25 e p29. E’ stato dimostrato che l’overespressione di p25 in topi transgenici causa un aumento dell’attività di CDK5 e iperfosforilazione di Tau.

P35, la subunità regolatoria di CDK5, è codificata dal gene CDK5R1 (Cyclin-Dependent Kinase 5 Regulatory subunit 1), che presenta un 3’UTR molto lungo e conservato, una caratteristica che suggerisce un suo ruolo nel controllo post-trascrizionale dell’espressione di CDK5R1. All’interno del 3’UTR di CDK5R1 abbiamo predetto un elevato numero di siti target per miRNA, in particolare per il miR-107. Questo miRNA sembra essere implicato nella progressione della malattia di Alzheimer. In uno studio in cui il miR-107 veniva overespresso nelle cellule di neuroblastoma SK-N-BE mediante trasfezione del suo precursore specifico, abbiamo osservato una significativa riduzione dell’espressione di p35, mentre la trasfezione dell’anti-miR-107 portava ad un aumento dei livelli di p35. Questi dati indicano che un’alterata espressione del miR-107 potrebbe essere implicati nell’Alzheimer influenzando i livelli di CDK5R1 e, di conseguenza, l’attività di fosforilazione su Tau di CDK5.

Al fine di identificare e validare i siti di legame per il miR-107 nel 3’UTR di CDK5R1, intendiamo generare costrutti luciferasici con porzioni diverse del 3’UTR che contengono siti di legame per il miR-107, normali o mutati. La co-trasfezione di tali costrutti con il miR-107 o l’anti-miR-107 in linee cellulari neuronali verrà utilizzata per chiarire il ruolo di ciascun sito target nella regolazione del trascritto. In maniera analoga verrà verificato se altri miRNA possano essere implicati nella regolazione di CDK5R1.Verrà inoltre condotta l’analisi dell’espressione di CDK5R1 e di diversi miRNA mediante PCR Real-Time su tessuto cerebrale congelato derivante da pazienti affetti da Alzheimer o individui di controllo, per verificare se esiste una co-deregolazione fra i miRNA analizzati e CDK5R1. Negli stessi tessuti di pazienti con l’Alzheimer e di controllo, saranno valutati anche i livelli di p25/p35 e l’attività di fosforilazione su Tau di CDK5, al fine di stabilire se c’è una correlazione fra i livelli di determinati miRNA, di CDK5R1 e di p25/p35, l’attività di CDK5 e i livelli di fosforilazione di Tau, e se questi livelli risultano alterati nei tessuti di pazienti con l’Alzheimer. Successivamente verranno studiati gli effetti della trasfezione di miRNAs/anti-miRNA in neuroni linee neuronali immortalizzate, in particolare sui livelli di p25/p35 e sull’attività di CDK5 nel fosforilare Tau. Si prevede inoltre di effettuare esperimenti di microarray e di elettroforesi bidimensionale sulle cellule neurali trasfettate con i miRNA selezionati, per identificare quei geni che sono regolati negativamente dai suddetti miRNA.

Questo studio ha come scopo generale quello di fornire nuove conoscenze sui meccanismi molecolari alla base della regolazione dell’attività del complesso p25/p35/CDK5 e di identificare  possibili cause della degenerazione neurofibrillare nella malattia di Alzheimer, con la prospettiva di far emergere strategie che possano costituire il punto di partenza per la messa a punto di nuovi protocolli terapeutici per la cura di questa malattia.

Principal Investigators:
  • marco VENTURIN
Financing institution:
MINISTERO DELL'ISTRUZIONE, DELL'UNIVERSITA' E DELLA RICERCA
Type:
FIRB-FiR08 - FIRB bando Futuro in Ricerca 2008
Project leader:
UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI TRENTO
Year:
2010
Duration:
36
Status:
CHIUSO
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